2006年P(guān)iepenburg等研發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA），該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實(shí)現(xiàn)待測靶標(biāo)的快速檢測。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對儀器依賴程度低且可整合多種檢測模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場即時(shí)檢測。

      RPA反應(yīng)由3種關(guān)鍵酶（重組酶Uvs X、單鏈結(jié)合蛋白Gp32以及鏈置換DNA聚合酶）、能量供應(yīng)體系（三磷酸腺苷、磷酸肌酸以及肌酸激酶）、穩(wěn)定反應(yīng)體系（Tris、醋酸鉀、高分子量聚乙二醇以及二硫蘇糖醇等）、三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）、醋酸鎂等成分組成。

   RPA反應(yīng)基本原理如下圖，主要包含5個(gè)階段：

（1）在三磷酸腺苷供能的條件下，重組酶輔因子（Uvs Y）協(xié)助Uvs X與反應(yīng)體系中的引物結(jié)合，形成酶-引物復(fù)合體，該復(fù)合體在反應(yīng)體系中尋找雙鏈DNA同源序列［3］；

（2）在同源序列處發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成D環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)Gp32與被置換的DNA單鏈結(jié)合進(jìn)一步穩(wěn)定D環(huán)結(jié)構(gòu)；

（3）Uvs X從酶-引物復(fù)合體中解離，DNA聚合酶識別引物游離的3′-OH端，添加dNTPs啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)；

（4）模板母鏈分離，DNA子鏈合成；

（5）兩DNA子鏈合成完畢。該過程不斷循環(huán)實(shí)現(xiàn)檢測靶標(biāo)的指數(shù)擴(kuò)增直到反應(yīng)體系中能量消耗殆盡。

      目前，仍沒有一款專用的軟件可供用戶設(shè)計(jì)RPA反應(yīng)所需的引物和探針。RPA引物、探針設(shè)計(jì)對RPA反應(yīng)有重要影響，RPA引物長為30~35個(gè)堿基，不同引物、探針組合有不同的擴(kuò)增效率，為達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期，進(jìn)行多次篩選是必要的。探針堿基錯(cuò)配將影響擴(kuò)增效率，出現(xiàn)假陽性結(jié)果并總結(jié)了熒光檢測法探針的要點(diǎn)（熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間1~2個(gè)堿基，盡可能降低G含量等）。

       基于多年來默瑞生物對Twistdx RPA相關(guān)產(chǎn)品的市場推廣工作，我們有多年豐富經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)服務(wù)團(tuán)隊(duì)。應(yīng)廣大科研工作者的實(shí)際需求，推出以下服務(wù)項(xiàng)目。

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表1：

表2：

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